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“GOTI”技術讓基因編輯脫靶無處隱藏

文章來源:神經所  |  發布時間:2019-03-04  |  【打印】 【關閉

  

  3月1日,《科學》發表了一篇名為《胞嘧啶單堿基編輯會導致大量單核苷酸突變的脫靶》的研究論文,該研究由中國科學院神經科學研究所(中國科學院腦科學與智能技術卓越創新中心)、上海腦科學與類腦研究中心、神經科學國家重點實驗室、中國科學院靈長類神經生物學重點實驗室楊輝研究組與中國科學院上海營養與健康研究所隸屬的計算生物學研究所(中國科學院-馬普學會計算生物學伙伴研究所)、斯坦福大學遺傳學系以及中國農業科學院深圳農業基因組研究所合作完成。該研究建立了一種被命名為GOTI(Genome-wide Off-target analysis by Two-cell embryo Injection)的新型脫靶檢測技術,并使用該技術發現: 近年來興起的單堿基編輯技術有可能導致大量無法預測的脫靶,因而存在嚴重的安全風險。此研究顯著提高了基因編輯技術脫靶檢測的敏感性,并且可以在不借助于任何脫靶位點預測技術的情況下發現之前的脫靶檢測手段無法發現的完全隨機的脫靶位點,為基因編輯工具的安全性評估帶來了突破性的新工具,有望成為新的行業檢測標準。

  CRISPR/Cas9是廣泛關注的新一代基因編輯工具,自從2012年被發明以來,它一直以其高效性和特異性備受世人的期待,學術界普遍認為基于CRISPR/Cas9及其衍生工具的臨床技術將為人類的健康做出巨大貢獻。然而值得注意的是,CRISPR/Cas9從問世以來,其脫靶風險一直備受關注,如果將CRISPR/Cas9及其衍生工具用于臨床的話,脫靶效應可能會引起包括癌癥在內的很多種副作用。在此之前,人們推出過多種檢測脫靶的方案。以前的方法或者依賴于計算機軟件預測,或者依賴于高通量測序檢測DSB產生,還有體外檢測的方法。這些方法都存在一些局限性,不能高靈敏性檢測到脫靶突變,尤其是單核苷酸突變。因此關于CRISPR/Cas9及其衍生工具的真實脫靶率一直存在爭議。因此一種能夠突破之前限制的脫靶檢測技術,將會成為CRISPR/Cas9及其衍生工具是否能最終走上臨床的關鍵。人們迫切希望可以找到一種既能夠不依賴于脫靶位點預測,又能有足夠信噪比的精密脫靶檢測手段。

  因此,如果要提升檢測脫靶效應的精度,就必須徹底顛覆原有的脫靶檢測手段。首先,為了實現不借助于脫靶位點預測,這就要求必須找到非常嚴格的對照組來確定基因突變的位點;同時為了檢測不依賴于sgRNA的隨機突變,最好使用基于單細胞全基因組測序。為了實現以上目標,楊輝研究組與合作者建立了一種名叫“GOTI”的脫靶檢測技術。研究者們在小鼠受精卵分裂到二細胞期的時候,編輯一個卵裂球,并使用紅色熒光蛋白將其標記。小鼠胚胎發育到14.5天時,將整個小鼠胚胎消化成為單細胞,利用流式細胞分選技術基于紅色熒光蛋白,分選出基因編輯細胞和沒有基因編輯細胞,再進行全基因組測序比較兩組差異。這樣就避免了單細胞體外擴增帶來的噪音問題。而且由于實驗組和對照組來自同一枚受精卵,理論上基因背景完全一致,因此直接比對兩組細胞的基因組,其中的差異基本就可以認為是基因編輯工具造成的。

  在楊輝實驗室全體成員與合作單位的共同努力下,GOTI系統被成功建立了起來。借助于這個系統,團隊成員先是檢測了最經典的CRISPR/Cas9系統。結果發現,設計良好的CRISPR/Cas9并沒有明顯的脫靶效應,這個結果結束了之前對于CRISPR/Cas9脫靶率的爭議。然而團隊還檢測了另一個同樣被給予厚望的CRISPR/Cas9衍生技術BE3,這個系統可以精確引入點突變,在之前的研究中從未發現過有明顯的脫靶問題。然而在GOTI的檢測下發現,BE3存在非常嚴重的脫靶,而且這些脫靶大多出現在傳統脫靶預測認為不太可能出現脫靶的位點,因此之前方法一直沒有發現其脫靶問題。團隊分析后認為,這些脫靶位點有部分出現在抑癌基因上,因此經典版本的BE3有著很大的隱患,目前不適合作為臨床技術。研究團隊的這些重要發現,證實了以BE3為代表的部分基因編輯技術存在無法預測的脫靶風險,讓世人重新審視了這些新興技術的風險。更重要的是,此工作建立了一種在精度、廣度和準確性上遠超越之前的基因編輯脫靶檢測技術,有望由此開發精度更高、安全性更大的新一代基因編輯工具,建立行業的新標準。

  該項工作由中科院神經所博士后左二偉(現任中國農業科學院深圳農業基因組研究所研究員),計算生物學所博士研究生孫怡迪,計算生物學所研究員魏武,中國農業科學院深圳農業基因組研究所助理研究員袁堂龍等科研人員,在中科院神經所楊輝研究員, 計算生物學所李亦學研究員,斯坦福大學Lars M. Steinmetz教授的共同指導下完成,課題組的其他成員積極參與,并得到了神經所流式分選平臺、動物平臺、基因編輯平臺的大力協助,是眾多課題組通力合作的重要成果。本工作得到國家高科技研發項目(2018YFC2000100與2017YFC1001302 to Yang Hui, 2017YFC0908405 to WW),中科院戰略性先導科技專項(XDB32060000),國家自然科學基金委員會(31871502, 31522037),上海市科技重大項目(2018SHZDZX05),上海市科學技術委員會項目(18411953700, 18JC1410100),美國國立衛生研究院P01項目(P01HG00020527 to L.M.S.)等項目的資助。

  

 

  

  圖1 GOTI技術的原理及實驗流程:(A) 實驗流程. (B) 脫靶位點數目比較。Cre-, Cas9-, BE3- and ABE7.10組分別有14+/-12 (SEM, n=2),12+/-4 (SEM, n=11),283+/-32 (SEM, n=6)和10 +/- 5 (SEM, n = 4)個SNVs。(C) 突變類型的分布比較. 每個格子中的數字表示該種突變類型占全部突變的比例 (D) 脫靶SNVs富集在基因組中的轉錄區域。(E) Genes 包含脫靶位點的基因在細胞胚胎中有更高的表達量。

觀察胚胎培養情況  

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